ضدیخ های نفوذپذیر بواسطه ی خاصیت آبدوستی بالای خود، با ملکول های آب موجود در محیط کشت میانکنش می دهند، این میانکنش موجب افزایش نفوذ ضدیخ به داخل سلول می شود. وجود ضدیخ در فضای داخل سلول باعث بالا رفتن ویسکوزیته ی مایع درون سلول و کاهش دمای لازم برای تشکیل کریستال یخ در داخل سلول میگردد، بنابراین استفاده از غلظتهای بالای ضدیخ، باعث افزایش ویسکوزیته ی داخل سلول، جلوگیری از تشکیل و تجمع هسته های یخی و در نتیجه جلوگیری از آسیب غشایی می شود. خروج آب در حین فرآیند آبگیری از داخل سلول، باعث چروکیدگی سلول و افزایش غلظت نمک ها در داخل سلول می شود که می تواند اثرات نامطلوبی بر سلول اعمال نماید. نفوذ ضدیخ به داخل سلول، با رقیق سازی مواد موجود در سلول، سبب جلوگیری از اثرات نامطلوب ناشی از میانکنش های مضر میان ترکیبات مختلف داخل سلول می گردد (28).
ب: عملکرد ضدیخ های نفوذ ناپذیر
ضد یخ های نفوذ ناپذیر مانند ترهالوز و سوکروز با وجود وزن مولکولی بالا نمی توانند به داخل سلول نفود کنند و با افزایش اسمولاریته در محیط اطراف سلول به فرآیند آبگیری کمک کرده و همچنین با افزایش ویسکوزیته ی محیط کشت باعث کاهش دمای تشکیل کریستال یخ در حین انجماد می شوند (24, 28).
ج: عملکرد مشترک ضدیخ های نفوذ پذیر و ضد یخ های نفوذ ناپذیر
از جمله دیگر ویژگی های ضد یخ ها می توان حفظ سلامت غشای دو لایه ی سلول و پروتئین های سلولی را نام برد. در این مورد ضد یخ های نفوذ پذیر مانند DMSO و ضد یخ های نفوذ ناپذیر مانند سوکروز ایفای نقش می کنند، این ضد یخ ها با پیوند های الکتروستاتیکی که با فسفولیپید های غشا ایجاد می کنند، باعث حفظ پایداری غشا سلولی می شوند (26).
1-2-3-2-سرم
سرم در محیط پایه برای حفظ سلول ها، بافت و کاهش اثرات مخرب ضدیخ ها مورد استفاده قرار می گیرد. در گذشته محققان بر این باور بودند که وجود سرم در محیط انجمادی سلول یا بافت، مانند سلول های اسپرماتوگونی (14, 29)، بافت تخمدان (30) و بافت بیضه (31-33) اثرات مثبتی در حفظ نمونه ی انجمادی دارد. در همهی این تحقیقات میزان سرم مصرفی 5% تا 20% گزارش شده است. با این حال پژوهشی که در سال 2013 انجام شد، نشان داد که، افزایش غلظت سرم در محیط انجمادی باعث افزایش بقای سلولی نمی شود. بنابراین می توان با کاهش میزان سرم در محیط انجمادی هزینه های مصرفی روش های انجمادی را تا حدودی کاهش داد (34).
1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه
از آنجاییکه انجماد بافت بیضه گزینه ی مهمی در حفظ باروری پسران نابالغ مبتلا به سرطان است، دستیابی به مطلوبترین روش جهت حفظ بافت بیضه بسیار پراهمیت است. روش های انجمادی بر تمامیت بافت بیضه، حفظ و تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی، عملکرد سلولهای محافظت کننده (سرتولی) و بقای سلول ها تاثیر گذارند، از این رو محققان در راستای ارزیابی این اثرات بر بافت بیضه تحقیقات مختلفی را انجام داده اند. Millazo و همکاران با ارزیابی روش های مختلف انجمادی، تکنیک انجماد آهسته بوسیله ی ضد یخ DMSO را نه تنها به عنوان تکنیکی موثر برای حفظ ساختار بیضه، بلکه برای حفظ عملکرد بیضه نیز پیشنهاد کردند (33). در سال 2011 آزمایشی در راستای بررسی اثرات عوامل دخیل در انجماد بافت بیضه انجام شد، این گروه با بررسی عوامل مختلف دخیل در انجماد (مانند اندازه بافت، نوع ضد یخ، غلظت ضد یخ و…) روش انجمادی مطلوبی را جهت انجماد بافت بیضه رت پیشنهاد کردند. این گروه بهترین حالت انجماد بافت بیضه را، انجماد بافت بیضه ی5/7 mg موش صحرایی با غلظت 5/1 مولار DMSO پیشنهاد کردند (35). بدنبال آن در سال 2012 ارزیابی هایی که به منظور بررسی تاثیرات سن، حالت نمونه (به شکل بافت و یا سوسپانسیون سلولی) و غلظت ضد یخ مورد استفاده انجام شد حاکی از آن بود که بافت بیضه ی نابالغ در مقایسه با بافت بیضه ی بالغ نسبت به ضد یخ ها حساس تر بوده و انجماد بیضه به صورت بافت، مطلوبتر از انجماد آن به صورت سوسپانسیون سلولی است، چرا که زنده مانی سلولها در انجماد بافت بالاتر از انجماد سوسپانسیون سلولی است. این تحقیق نیز DMSO را به عنوان ضدیخ مناسب برای انجماد بافت بیضه نابالغ وEG را به عنوان ضد یخ مناسب برای انجماد بافت بیضه ی بالغ در انسان پیشنهاد کرد (36). تا به امروز مطالعات مختلفی به منظور مقایسه ی روش های انجمادی مختلف انجام شده است، به طوری که در سال 2011 آزمایشی طراحی و انجام شد که در آن 3 روش انجمادی با یکدیگر مقایسه شده بودند، علاوه بر آن اثر حالات مختلف بافت بیضه (از لحاظ وجود، عدم وجود و دستکاری تونیکا آلبوجینا و نحوه ی برش بافت) در نتیجه ی انجماد نیز مورد بررسی قرار گرفت. به طوریکه بافت بیضه در 4 حالت، بدون تونیکا، بافت بیضه با تونیکای دستکاری شده (ایجاد منافذی در تونیکا آلبوجینا به وسیله ی سوزن به منظور نفوذ پذیر ساختن بافت جهت نفوذ ضدیخ)، با تونیکای سالم و بافت بیضه ای که به صورت طولی برش خورده بود، تحت انجماد واقع شدند و نتایج نشان داد زمانیکه بیضه بصورت طولی برش می خورد و یا با سوزن دستکاری می گردد، میزان زنده مانی سلولها در مقایسه با دو حالت دیگر بسیار بالاتر است. از طرفی روش انجماد شیشه ای به عنوان روشی بهینه در زمان و هزینه برای حفظ بافت بیضه و سلولهای اسپرماتوگونی مطرح شد (37). در سال 2012 Baert و همکاران آزمایشی انجام دادند که در آن نرخ موفقیت پس از انجماد شیشه ای و انجماد آهسته در یک سطح نشان دادند، به گونه ای که پس از انجماد شیشه ای فراساختار سلولهای اسپرماتوگونی، مورفولوژی توبولهای بیضه ای و عملکرد بافت بیضه ای به خوبی حفظ شده بود (38). این مطالعات مستنداتی را ارائه کرد که نشان داد تکنیک انجماد شیشه ای روشی ساده، ارزان و مطلوب بوده و می تواند به عنوان روشی کارآمد جهت حفظ بافت بیضه استفاده شود. Poels و همکاران نیز در سال 2012 با مطالعه ای که در مورد انجماد شیشه ای بافت بیضه و پیوند آن انجام دادند، اعلام کردند که تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی و عملکرد سلولهای لایدیگ پس از انجماد شیشه ای و پیوند بافت حفظ می شود (39). امروزه برای بازیابی باروری پس از انجماد بافت بیضه سه روش آزمایشگاهی: پیوند بافت بیضه ی منجمد شده، کشت و بلوغ آزمایشگاهی بافت بیضه و استخراج، کشت و تمایز سلولهای اسپرماتوگونی مطرح است.
3-1-3-پیوند
مطالعات in Vivo پس از انجماد بافت بیضه نتایج امیدوار کننده ای را در پی داشت. در انسان پیوند زنوگرفت بافت بیضه ی منجمد شده با روش انجماد آهسته به موش nude پس از شش ماه، حفظ قدرت تکثیر و تمایز سلولی را در بافت بیضه ی منجمد و ذوب شده نشان داد. علاوه بر آن، تمامیت لوله های سمی نفروس در نمونه های کنترل، انجماد آهسته و انجماد شیشه ای پیوند شده، به خوبی نمونه های تازه ی پیوند نشده حفظ شده بود (40). تنها نقطه ضعف این مطالعه کاهش چشمگیر تعداد سلولهای اسپرماتوگونی در نمونه های انجمادی (آهسته و شیشه ای) و نمونه های کنترل پیوند شده بود (40) که آنرا می توان به نقص در فرآیند پیوند نسبت داد. به نظر می رسد آنچه سبب کاهش تعداد سلولهای اسپرماتوگونی پس از پیوند می گردد تاخیر در خون رسانی مجدد بافت پیوندی و آپوپتوز سلول ها باشد(41). آپوپتوز فرایندی است که در مراحل ابتدایی پیوند حادث می شود به صورتی که در سه روزه ی اول پیوند میزان آپوپتوز در بافت بالا رفته (21) و بتدریج و تا هفتهی سوم میزان آن کاهش چشم گیری می یابد (22) و تا ماه ششم نیز روند کاهش آپوپتوز ادامه می یابد (21). ایسکمی بافت می تواند باعث آسیب به سلولهای اسپرماتوگونی، سلولهای سرتولی، سلولهای میویید، تخریب سیستم خونرسانی داخل بافت بیضه و غیره شود که همگی لازمه ی حفظ کنام سلولهای اسپرماتوگونی هستند (42, 43) در راستای بررسی حفظ عملکرد سلول های موجود در بیضه، Abrishami و همکاران با مطالعه ی انجماد بافت بیضه خوک و پیوند آن به موش نتیجه گرفتند که پس از دو فرآیند انجماد و پیوند، بافت اسپرماتوژنزیس طبیعی خود را از سرگرفته و اسپرماتید طویل حاصل می شود (32).
4-1-4-کشت

مطالعات کشت آزمایشگاهی بافت بیضه که از یک سده ی پیش آغاز شده است، پایه ای جهت مطالعهی فرآیند اسپرماتوژنزیس در آزمایشگاه ایجاد کرده است. در سال های اخیر به منظور بررسی اثرات انجماد بر روی بافت بیضه از کشت Insert استفاده شده است (23). Sato و همکاران در سال 2011 کشت بافت بیضه بر روی آگار را به عنوان روشی مناسبی برای تکمیل فرآیند اسپرماتوژنزیس در شرایط آزمایشگاهی معرفی کردند و توانستند با تزریق درون سیتوپلاسمی8 اسپرم های حاصل از این روش، نوزادان موش سالم و بارور تولید کنند.
وجود سرم در محیط کشت برای رشد و تکوین بافت بیضه اهمیت دارد و عدم وجود سرم در محیط کشت مانع تقسیم سلولی و رشد قطری لوله های سمی نفروس می شود. کشت بافت بیضه در محیط کشت حاوی سرم و در دمای 34 درجه ی سانتیگراد به عنوان روشی مناسب برای کشت است (44). در مقایسه بین عوامل تغذیه کننده ی بافت بیضه در محیط کشت، 9KOSR در مقایسه با FBS10باعث افزایش شدت اسپرماتوژنزیس و افزایش طول مدت زمانی که بافت توانایی اسپرماتوژنزیس را دارد می شود. محیط های کشت 11RPMI و ?-MEM12 باعث تکوین بهتر بافت بیضه ی کشت داده شده می شوند (44). افزایش غلظت سرم، افزودن هورمون ها و عوامل مختلف به محیط کشت موجب بهبود کیفیت تکوین بافت بیضه نمی شود، چه بسا ممکن است اثرات مخربی نیز در تکوین بافت بیضه داشته باشد (44). Sato و همکارانش در ادامه ی مطالعاتشان در سال 2013 با کشت موفقیت آمیز بافت بیضه ی موش نابالغ منجمد شده با روش های انجماد آهسته و شیشه ای بر روی آگار توانستند به اسپرماتید گرد و اسپرم بالغ دست پیدا کنند و از طریق تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم و تزریق اسپرماتید گرد در تخمک13 توانستند به نوزاد سالم دست یابند (45).
1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد
انجماد تکنیکی است که به صورت گسترده و از چندین دهه ی پیش در روش های کمک باروری مورد استفاده قرار گرفته است. مطالعات اخیر نشان می دهند که تکنیک های انجمادی باعث ایجاد تغییرات ملکولی مانند شکست DNA، حذف، اضافه شدن یا تغییر در بازهای آلی و ایجاد کراس لینک در ساختار DNA سلول در سطوح مختلف چرخه ی سلولی مانند M ,G2 ,S ,G1 می شود. از سوی دیگر آسیب DNA در اسپرم موجب باروری ضعیف، اختلال در تکوین جنین، افزایش نرخ سقط و همچنین ایجاد بیماری در نوزادان می شود(46). انجماد علاوه بر آسیبی که به DNA وارد می کند باعث کاهش و یا حذف رونوشت برخی از ژن های مهم در اسپرم می گردد که برای لقاح و تکوین جنین حایز اهمیت هستند (47). همچنین مشاهده شده که انجماد تیغه ی تناسلی ماهی گورخری14 موجب ایجاد تغییرات نامطلوب در سلول ها و تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در ژن های مرتبط با تکوین و تمایز سلول ها می شود (48). مطالعات نشان می دهد انجماد (آهسته و شیشه ای) و پیوند بافت بیضه در انسان سبب تغییر در بیان ژن های MAGE-A415 (ژن مبین سلول های زایا)، 3?-HSD16 (شاخص سلول های لایدیک) در سطح پروتئین می شود، ولی در بیان ژن Ki67 (ژن مرتبط با تکثیر سلولی) تغییری ایجاد نمی کند (40). همچنین کشت کوتاه مدت بافت بیضه ی موش نابالغ پس از انجماد (آهسته و شیشه ای) افزایش میزان بیان ژن Ki67 در سطح پروتئین را نشان داد (23). درتحقیقی که در سال 2007 انجام شد، تغییری در بیان ژن ویمنتین (از جمله پروتیین های اسکلت سلولی) و CD34 (ازجمله پروتیین هایی که در اتصال سلول ها نقش دارند) در سطح پروتیین پس از انجماد و ذوب بافت بیضه انسان در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد ولی بیان ژن MAGE-A4 پس از انجماد کاهش داشت (49). اینگونه به نظر می رسد که تغییرات مذکور در بیان پروتئین های مختلف پس از انجماد، پیوند و کشت بافت بیضه با تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در سطح ژن مرتبط باشد.
1-5-1-آپوپتوزیس17
مرگ سلولی توسط مسیر های مجزا در حین فرآیند آپوپتوز با تغییرات بیوشیمیایی مانند فعال شدن کاسپازهای آغازگر و اجرایی، آزاد شدن سیتوکروم c، قرارگیری مانند نکروز18، آپوپتوز (50) و اتوفاژی19(51) اتفاق می افتد. آپوپتوز مرگ سلولی است که به واسطه ی تغییرات مورفولوژیک مانند چروکیدگی غشا سلول، متراکم شدن کروماتین، از بین رفتن یکپارچگی غشا هسته، ایجاد حباب در سلول20 و تشکیل اجسام آپوپتوزی21 قابل تشخیص است (52). تغییرات مورفولوژیک فسفاتیدیل سرین در نیم لایه ی خارجی، شکست و غیرفعال شدن 22PARP و تشکیل قطعات اینترانوکلئوزمال23 همراه است (53). لزوما تمامی وقایع ذکر شده در تمامی رده های سلولی مشاهده نمی شود و با توجه به نوع رده ی سلولی فقط تعدادی از این اتفاقات در حین آپوپتوز مشاهده می شود. دوره ی زمانی بروز حوادث بیوشیمیایی آپوپتوز نیز به عوامل مختلف مانند نوع سلول یا بافت، غلظت مواد مورد استفاده برای تیمار و زمان قرارگیری در برابر عوامل القاگر آپوپتوز که در تیمار سلول یا بافت استفاده شده است بستگی دارد (54, 55). دو مسیر عمده که باعث پیشبرد آپوپتوز می شوند عبارتند از: مسیر خارجی یا غشایی24 و مسیر داخلی یا میتوکندریایی25. هر یک از مسیرهای ذکر شده توانایی اثر گذاری و فعال سازی مسیر دیگر را دارند. در بافت بیضه نیز بدلیل تقسیمات متوالی میوز و میتوز احتمال ایجاد سلولهای ناکارآمد از لحظ ژنتیکی بسیار زیاد است و فرآیند آپوپتوز در بافت بیضه باعث از بین رفتن چنین سلولهایی می شود (56).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-5-1-1 مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن

  • 1
دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید